En los últimos años hemos observado grandes avances en el campo de la genómica. El descubrimiento en 1953 de la estructura del ácido desoxirribonucleico (ADN) por James Watson, Francis Crick y Rosalind Franklin resultó clave para entender el actual desarrollo de la “Tecnología del ADN Recombinante”.
Se han desarrollado múltiples técnicas de manipulación genética con objetivos diversos, no obstante, la forma más específica de edición genómica se ha conseguido mediante unas tijeras moleculares que permiten cortar en puntos determinados e insertar los cambios deseados con mayor exactitud. Esta técnica, reconocida con el premio Nobel de Química en 2020, se conoce como CRISPR/Cas9 y fue desarrollada por las científicas Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna, aunque su descubrimiento fue el resultado de los trabajos de investigación de Francis Mojica. En esta publicación de Lluís Montoliu podéis leer sobre la importancia de los trabajos de Mojica para el desarrollo de esta revolucionaria técnica de edición genética.
Para entender el funcionamiento del sistema CRISPR/Cas hay que conocer el mecanismo por el que se inmunizan las bacterias. Este sería el primer descubrimiento que ha permitido el desarrollo del sistema de edición genética CRISPR/Cas.
La inmunidad bacteriana. El origen del Sistema CRISPR/Cas
Algunas bacterias y la mayoría de arqueas (microorganismos unicelulares procariotas) presentan un sistema de defensa adaptativo contra infecciones víricas mediante unas endonucleasas guiadas por ARN, conocidas como Cas. Este sistema se conoce como CRISPR (acrónimo en inglés de Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas). Estos microorganismos adquieren la inmunidad mediante la introducción de pequeñas secuencias de ADN foráneo (procedente de fagos o plásmidos) en el locus de CRISPR generando un registro de infecciones o huella digital.
Vamos a diferenciar dos niveles para entender cómo se inmunizan las bacterias. Por un lado el nivel genómico y, por otro, el nivel efector.
A nivel genómico, el sistema CRISPR/Cas de las células procariotas está formado por un locus CRISPR/Cas que contiene una agrupación de secuencias CRISPR (CRISPR array) y los genes asociados.
- CRISPR son secuencias de ADN compuestas de repeticiones de nucleótidos que separan regularmente secuencias únicas denominadas espaciadores (spicer). Estos espaciadores derivan de ácidos nucleicos invasores (procedentes de fagos o plásmidos) que actúan como una huella dactilar que le permiten a un huésped procariótico recordar a qué invasiones ha estado expuesto. Estas secuencias CRISPR codifican un precrRNA que es procesado para producir un crRNA que, a través de homología de secuencias, guía a la nucleasa Cas9 hacia los nucleótidos a silenciar.
- Los genes asociados son genes Cas que codifican varias nucleasas implicadas en la adquisición de nuevos espaciadores, en el procesado del precrRNA y en el corte y destrucción de elementos genéticos foráneos.
- Más allá de los genes Cas se encuentra la secuencia codificante del tracrRNA, que cumple un papel estructural, ya que asiste en el ensamblaje del complejo efector.
Por tanto, a nivel efector nos encontramos con: una nucleasa Cas9, el crRNA y el tracrRNA. El tracrRNA, que hibrida parcialmente con el crRNA e interacciona con Cas9, actúa como lugar de anclaje de ambos componentes. Así, el complejo efector verdadero queda conformado por crRNA:tracrRNA:Cas9.
El mecanismo de acción por el que el sistema CRISPR/Cas confiere inmunidad a procariotas puede explicarse en tres etapas:
- Adaptación: El ADN invasor es reconocido por una proteína Cas, es fragmentado e incorporado dentro del locus CRISPR, en la región spicer, siendo almacenado en el genoma de la célula huésped.
- Expresión: Mediante la transcripción de la región CRISPR se genera precrRNA que se fragmenta en unas unidades más pequeñas llamadas crRNA.
- Interferencia: El crRNA y el tracrRNA transcritos se ensamblan con Cas9 formando el complejo efector crRNA:trarRNA:Cas9. Este complejo rastrea el espacio celular en busca de secuencias de nucleótidos foráneos que hibriden con el crRNA, una vez es localizado e hibridado Cas9 introduce un corte (DSB, Double Strand Break) y lo inhabilita.
Una vez analizada toda la biología del proceso de defensa inmune, se puede afirmar que la transcripción del locus CRISPR (que da lugar a los crRNAs) es la base del mecanismo de defensa procariota contra el material genético exógeno. En este proceso, una pequeña secuencia adyacente a la secuencia del material genético del organismo invasivo que es adquirida como espaciadora en el locus CRISPR juega una gran importancia; esta es la secuencia denominada PAM, que consiste en un fragmento de nucleótidos, variable entre especies, fundamental para el reconocimiento de la zona diana donde la endonucleasa Cas va a actuar.
La endonucleasa Cas9 es una proteina de acción enzimática tiene una forma bilobular consituida por un lóbulo de acción nucleasa NUC y un lóbulo de reconocimiento REC, entre los dos lóbulos hay un canal donde se inserta el segmento de ARN en la etapa de interferencia. La neutralización del material genético exógeno comienza por el reconocimiento por la enzima Cas de la secuencia PAM y del ARN complementario a dicha secuencia. De esta forma se origina un complejo constituido por el complejo de ARN y Cas9. Seguidamente tendrá lugar el apareamiento de bases entre el ADN infectivo y el crARN y se producirá la escisión de la secuencia diana y la destrucción del organismo infectante.
El Sistema CRISPR/Cas9 como herramienta de edición genética
El crRNA y el tacrRNA necesarios para la activación de Cas9 pueden transformarse en un RNA quimérico, el sgRNA (single guide RNA), que dirija eventualmente a Cas9 contra una secuencia concreta del genoma de cualquier organismo. Esto convierte a Cas9 en una nucleasa programable a través de una ARN sintético.
Tras la escisión de la secuencia del ADN diana por Cas9 se generan unas roturas en la doble cadena del ADN (DSB) susceptibles de ser reparadas por la maquinaria celular. Estos patrones de reparación son aprovechados por los investigadores para generar modificaciones en lugares concretos del genoma en los que se está trabajando.
Existen dos mecanismos de reparación del ADN: el sistema NHEJ (Non-homologous end joining) y el HDR (Homology directed repair). NHEJ produce “cicatrices” en el lugar donde actúa comportando errores en forma de delecciones o inserciones de nucleótidos que pueden dar lugar a la aparición de codones de parada (secuencias de trinucleótidos en el ARNm que señalan un alto en la síntesis de proteinas) prematuros y el consiguiente silenciamiento de genes. HDR solo puede tener lugar ante la presencia de una secuencia de nucleótidos añadida de forma exógena; por tanto es un sistema susceptible de poder usarse como herramienta de modificación altamente precisa (pues es el propio investigador el que decide cuál será la secuencia que será introducida en el lugar de la escisión). En condiciones naturales, estas dos vías de reparación están activas en las células; no obstante, en presencia de una plantilla de ADN adecuada, la reparación HDR pemite arreglar sin errores la doble rotura del ADN.
Pasos para editar con CRISPR/Cas
- En primer lugar, hay que conocer la secuencia de la región del genoma sobre la que se va a dirigir CRISPR/Cas. Seguidamente, hay que detectar PAMs en la región de interés, condición indispensable para que Cas9 pueda unirse a dicha región y cortar el DNA. La elección de la secuencia diana del gen de interés depende del tipo experimento a llevar a cabo.
- A continuación, debe diseñarse un sgRNA adecuado, que hibride con la secuencia diana, con especial atención a los requisitos para maximizar la eficiencia de la actividad de Cas9 (on-target) y minimizar la actividad fuera de la diana (off-target). Existen numerosas herramientas bioinformáticas que permiten obtener sgRNAs eficientes y específicos.
- Posteriormente, es necesario seleccionar un sistema de expresión y liberación que permita ingresar, en la célula u organismo, los componentes básicos de la maquinaria CRISPR/Cas9: el sgRNA y Cas9.
- Finalmente, hay que validar la edición, es decir, detectar y demostrar que se han introducido las mutaciones génicas en las secuencias diana y no en otras regiones.
Por tanto, el sistema CRISPR/Cas9 puede actuar como unas tijeras moleculares de gran precisión y permite, entre otras posibilidades, corregir erratas del genoma o mutaciones responsables de enfermedades genéticas. Aunque la aplicación de esta tecnología en plantas y animales resulte de gran interés, la gran promesa se situa en la posibilidad de dar con el tractamiento de enfermedades con una base genética. También es importante recordar que la combinación CRISPR con inmunoterapia puede servir para tratar diferentes tipos de cánceres.
Evidentemente estamos en los inicios de una tecnología prometedora pero aún existen algunas dificultades que es preciso resolver ya que, dada la naturaleza permanente de los cambios de ADN producidos, las exigencias para una terapia génica segura deben ser muy altas.
Fuentes:
- Mayboca Padilla, & Flores Ruiz, D. (2019). CRISPR/CAS: EL FUTURO DE LA EDICIÓN GENÉTICA. Epistemus : Ciencia Tecnología y Salud, 13(26), 36–41. Disponible https://epistemus.unison.mx/index.php/epistemus/article/view/94/68
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. science, 337(6096), 816-821. Disponible a: https://www.science.org/doi/full/10.1126/science.1225829
- Pardo Piñón, M. (2017). Descripción del sistema CRISPR-Cas y diseño de sgRNAs (» single guide RNAs») para edición de ADN genómico en levaduras. Disponible a: https://ruc.udc.es/dspace/bitstream/handle/2183/19673/PardoPinon_Marta_TFG_2017.pdf.pdf
- Sternberg, S.H., «La revolución biológica de la edición genética con tecnología CRISPR», en ¿Hacia una nueva Ilustración? Una década trascendente. Madrid, BBVA, 2018. Disponible a: https://www.bbvaopenmind.com/articulos/la-revolucion-biologica-de-la-edicion-genetica-con-tecnologia-crispr/
- López Casillas, Fernando. (2015). CRISPR, el sueño divino hecho realidad. Revista de la Facultad de Medicina (México), 58(4), 55-60. Disponible a: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0026-17422015000400055
- Valor, J. V. (2018). TRABAJO FIN DE GRADO CRISPR: DE VERDUGO A CIRUJANO DEL GENOMA (Doctoral dissertation, UNIVERSIDAD COMPLUTENSE). Disponible a: http://147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/JUAN%20VICENTE%20VALOR.pdf
Realizar esta publicación me ha resultado de gran interés para poder comprender el funcionamiento de una tecnología que está revolucionando el campo médico.
Para finalizar os dejo con la imagen de una inquietante obra del escultor Juan Muñoz.
